百道网
 您现在的位置:Fun书 > 动物病毒样颗粒技术
动物病毒样颗粒技术


动物病毒样颗粒技术

作  者:郭慧琛,孙世琪

出 版 社:科学出版社

出版时间:2022年11月

定  价:298.00

I S B N :9787030733856

所属分类: 专业科技  >  自然科学  >  生物科学    

标  签:

[查看微博评论]

分享到:

TOP内容简介

《动物病毒样颗粒技术》将纳米技术概念引入动物疫苗研究领域在国内尚属首次,共包括14章,详细介绍了病毒样颗粒的基本特征及其在基础研究、药物呈递、疫苗工程等方面的应用价值,系统描述了应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统、酵母表达系统、活病毒载体表达系统、哺乳动物细胞表达系统、植物表达系统、原核表达系统、无细胞蛋白质合成表达系统等制备病毒样颗粒的策略、步骤或程序,同时还介绍了目的蛋白纯化鉴定的基本方法及产业化生产病毒样颗粒应注意的问题和解决思路。

TOP目录

目录
第一章绪论1
第一节病毒样颗粒的概念及特点1
一、病毒样颗粒的概念1
二、病毒样颗粒的特点及优势1
三、病毒样颗粒的不足2
第二节病毒样颗粒的分类3
第三节病毒样颗粒的发展历程3
一、病毒样颗粒技术的进展3
二、病毒样颗粒相关表达系统的发展4
三、病毒样颗粒组装技术的发展5
参考文献6
第二章杆状病毒-昆虫细胞表达系统9
第一节概述9
一、杆状病毒-昆虫细胞表达系统的优点9
二、杆状病毒载体9
三、宿主11
四、外源基因的表达13
第二节杆状病毒-昆虫细胞表达技术13
一、杆状病毒-昆虫细胞表达系统的发展13
二、高效表达策略15
第三节Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的VLP制备17
一、载体的选择17
二、目的基因的克隆21
三、培养昆虫细胞21
四、重组bacmid的构建21
五、使用PCR分析重组质粒22
六、VLP的制备23
第四节杆状病毒-昆虫细胞表达系统在VLP研究中的进展24
一、无囊膜病毒26
二、囊膜病毒28
三、瓶颈和问题30
四、展望34
五、附录34
参考文献41
第三章酵母表达系统44
第一节概述44
一、酵母表达系统简介44
二、常用酵母表达系统分类47
第二节酵母表达技术55
一、酵母表达技术概述55
二、酵母表达技术的高效表达策略56
第三节酵母表达系统在VLP研究中的进展61
一、概述61
二、酵母表达系统在人源病毒VLP中的研究62
三、酵母表达系统在动物病毒VLP中的研究65
第四节展望68
参考文献69
第四章活病毒载体表达系统74
第一节痘病毒表达系统74
一、痘病毒的分类74
二、痘病毒基因组特点74
三、痘病毒表达载体及其应用75
第二节腺病毒表达系统80
一、腺病毒生物学特点80
二、腺病毒的分类81
三、腺病毒感染及免疫应答机制83
四、重组腺病毒的构建85
五、腺病毒表达系统在VLP研究中的进展85
第三节腺相关病毒表达系统86
一、腺相关病毒病原学特点87
二、腺相关病毒衣壳组装87
三、腺相关病毒诱导的免疫应答88
四、重组腺相关病毒制备89
五、腺相关病毒递送系统的应用92
六、腺相关病毒递送系统发展展望94
第四节慢病毒表达系统94
一、慢病毒表达系统概述95
二、重组慢病毒制备与生产97
三、慢病毒表达系统的应用101
四、慢病毒载体系统发展展望103
五、附录103
参考文献105
第五章哺乳动物细胞表达系统108
第一节CHO细胞表达系统108
一、CHO细胞表达载体特征111
二、宿主细胞的优化113
三、真核表达载体转染技术113
四、哺乳动物细胞培养条件115
五、CHO制备VLP研究的进展116
第二节HEK293细胞表达系统119
一、HEK293细胞系发展历史119
二、HEK293细胞表达载体特征121
三、HEK293生产蛋白质制剂的优点122
四、HEK293真核表达载体的转染123
五、HEK293细胞制备VLP的研究进展123
第三节细胞培养工艺研究129
一、细胞培养环境的控制129
二、生物反应器130
三、动物细胞流加培养工艺131
四、流加培养的细胞代谢及其基因调控132
第四节稳定表达重组蛋白的哺乳动物细胞系133
一、利用绿色荧光蛋白(GFP)构建稳定表达细胞系134
二、利用慢病毒转导构建稳定表达细胞系135
三、利用噬菌体φC31整合酶构建稳定表达细胞系135
四、利用转座子构建稳定表达细胞系136
五、问题136
第五节展望136
参考文献137
第六章植物表达系统140
第一节植物表达系统概述140
一、植物表达系统的组成140
二、植物表达系统种类142
第二节植物表达系统表达技术143
一、植物表达系统常用载体及工程菌株143
二、提高目的蛋白表达水平的手段146
三、植物表达系统表达重组蛋白纯化工艺149
第三节植物表达系统在VLP中的研究进展151
一、囊膜病毒153
二、无囊膜病毒159
第四节展望162
参考文献163
第七章原核表达系统166
第一节大肠杆菌表达系统概述及技术166
一、大肠杆菌表达系统的组成166
二、大肠杆菌表达系统高效表达的策略169
三、VLP在大肠杆菌表达系统中的表达与组装173
第二节其他原核表达系统(乳酸菌、链霉菌)概述及技术174
一、乳酸菌175
二、链霉菌179
第三节原核表达系统在VLP中的研究进展181
一、囊膜病毒181
二、无囊膜病毒184
第四节展望189
参考文献190
第八章无细胞蛋白质合成系统195
第一节无细胞蛋白质合成系统发展史195
第二节无细胞蛋白质合成系统的优点和不足197
一、CFPS的优点197
二、CFPS存在的问题197
第三节无细胞蛋白质合成系统分类及研究进展198
一、细胞提取物来源CFPS199
二、“PURE”系统CFPS203
三、CFPS的生产方式204
第四节CFPS的主要应用领域205
一、特殊蛋白质的合成205
二、蛋白质高通量表达和筛选206
三、合成药物207
第五节CFPS在VLP制备中的研究进展207
一、无囊膜病毒207
二、囊膜病毒209
第六节展望212
参考文献212
第九章病毒样颗粒的表征技术215
第一节概述215
第二节生物化学分析技术216
一、MS技术216
二、SDS-PAGE技术218
三、RP-HPLC技术219
第三节生物物理学分析技术220
一、TEM220
二、Cryo-EM221
三、AFM222
四、DLS技术224
五、圆盘离心技术225
六、ES-DMA技术226
七、AF4技术227
八、Native-PAGE技术229
九、密度梯度离心技术229
十、AUC技术232
第四节免疫生物学分析技术234
一、ELISA技术234
二、SPR技术235
参考文献237
第十章动物病毒样颗粒疫苗241
第一节VLP疫苗概述241
一、VLP疫苗的优势241
二、VLP疫苗的多样性242
三、VLP疫苗的应用246
四、VLP疫苗的分类249
五、展望251
第二节VLP的免疫机制251
一、抗原呈递细胞的种类、功能251
二、抗原呈递细胞在VLP疫苗免疫中的作用254
三、B细胞及VLP诱导的B细胞免疫应答255
四、主要组织相容性复合体257
五、抗原呈递途径258
六、T细胞及VLP诱导的T细胞免疫应答259
第三节VLP疫苗的研究261
一、人类与人畜共患病VLP疫苗262
二、猪的VLP疫苗274
三、反刍动物的VLP疫苗279
四、禽类的VLP疫苗282
五、兔、鱼、犬、貂和猫的VLP疫苗287
参考文献292
第十一章病毒及病毒样颗粒作为纳米药物递送载体305
第一节纳米药物递送系统概述305
一、纳米药物递送系统305
二、常见纳米药物递送载体的分类及特性311
三、病毒及病毒样颗粒类纳米药物递送载体314
第二节病毒及病毒样颗粒承载药物的机制和原理316
一、从材料学与化学的角度看VNP/VLP316
二、VNP/VLP的解离-自组装特性317
三、物理吸附法317
四、化学修饰法318
第三节病毒及病毒样颗粒作为纳米药物递送载体的研究进展322
一、植物VNP/VLP作为纳米药物递送载体322
二、人/动物VNP/VLP作为纳米药物递送载体334
三、噬菌体VNP/VLP作为纳米药物递送载体340
四、展望345
参考文献345
第十二章病毒样颗粒作为核酸的递送载体348
第一节核酸类药物简介348
一、核酸类药物与基因治疗348
二、核酸类药物的现状和前景349
三、核酸类药物递送载体研究现状350
四、病毒样颗粒作为核酸类药物递送载体352
第二节病毒样颗粒递送核酸的机理和方法353
一、病毒样颗粒递送核酸的机理353
二、病毒样颗粒递送核酸的方法356
第三节病毒样颗粒递送DNA的研究进展357
一、病毒样颗粒递送DNA的研究358
二、病毒样颗粒递送DNA在人类病毒中的应用360
第四节病毒样颗粒递送RNA的研究进展365
一、病毒样颗粒递送RNA在人和动物中的应用365
二、病毒样颗粒递送RNA在植物中的应用367
三、病毒样颗粒递送基因短片段的研究367
第五节展望与不足371
参考文献372
第十三章病毒及病毒样颗粒作为新型功能纳米元/器件375
第一节病毒及病毒样颗粒与量子点375
一、量子点概述375
二、病毒及病毒样颗粒-量子点复合物378
三、病毒及病毒样颗粒-量子点复合物的研究进展379
第二节病毒及病毒样颗粒与金纳米颗粒385
一、金纳米颗粒概述385
二、病毒及病毒样颗粒-金纳米颗粒复合物的研究进展385
第三节病毒及病毒样颗粒在磁共振成像中的应用394
一、磁共振成像概述394
二、VNP/VLP与T1造影剂397
三、VNP/VLP与T2造影剂400
第四节病毒样颗粒与多模态成像404
一、多模态成像概述404
二、VNP/VLP在多模态成像中的应用406
三、展望410
参考文献410
第十四章病毒样颗粒在基础研究中的应用413
第一节病毒样颗粒的结构解析413
一、戊型肝炎病毒样颗粒的结构413
二、尼帕病毒样颗粒的结构415
三、β-诺达病毒样颗粒的结构416
四、猪圆环病毒样颗粒的结构418
五、柯萨奇B3病毒样颗粒的结构419
六、展望420
第二节病毒样颗粒的组装机制研究421
一、静电作用力421
二、渗透压422
三、核酸片段423
四、温度和pH425
五、热休克蛋白426
六、谷胱甘肽426
七、展望427
第三节病毒样颗粒模拟病毒的研究427
一、病毒样颗粒模拟病毒的生命周期428
二、病毒样颗粒模拟病毒的组织嗜性429
三、病毒样颗粒模拟病毒活化免疫应答430
四、展望433
参考文献433

TOP书摘

第一章绪论
  第一节病毒样颗粒的概念及特点
  一、病毒样颗粒的概念
  病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),广义上是指其在形态和粒子大小上与真正病毒粒子相同或相似;限于当时的研究水平,还无法进一步验证、分析其具体成分和特性,对这一类结构,统称为“病毒样颗粒”(Feller and Chopra,1968;Jokelainen et al.,1970)。目前,VLP多指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,不含有病毒核酸,俗称伪病毒颗粒或假病毒颗粒(Fuenmayor et al.,2017)。随着分子生物学技术的不断发展,利用非共价作用或共价作用修饰所获得的嵌合型 VLP,均属于病毒样颗粒的范畴。
  二、病毒样颗粒的特点及优势
  (1)VLP疫苗是近年来新出现的一种基因工程亚单位疫苗形式,其优点包括不含核酸,不能自主复制,安全性好,因此可成为更安全、更经济的候选疫苗。 VLP形式的亚单位疫苗可以避免活病毒来源的或灭活疫苗所导致的潜在危险性,如人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗、人乳头状瘤病毒(HPV)疫苗,因此,具有更高的安全性。
  (2)与单个蛋白质或肽相比, VLP的构象表位与天然病毒更相似,因此,可以显著地提高免疫应答水平。由于其表面的结构分子高度重复, VLP能够通过有效地交联 B细胞上的特异性受体,在没有佐剂的情况下诱导强烈的 B细胞免疫应答(Chackerian et al.,2002)。VLP可以模拟病毒的天然结构而使构象依赖型抗原表位得以正确呈现,具有良好的免疫原性;与传统的亚单位疫苗相比,VLP能像真实病毒粒子一样进入细胞,从而诱导有效细胞免疫应答(Greenstone et al.,1998;Sedlik et al.,1997)。甚至可以在较低剂量的情况下,即可诱导较强的免疫应答水平,从而显著降低疫苗成本。
  (3)在不影响 VLP结构的基础上,可以根据需要插入或删除某些氨基酸序列,对其进行人工改造,构建嵌合 VLP(Cuburu and Chackerian,2011;Kaufmann et al.,2001)。如果把自然病毒粒子中具有免疫抑制功能的特定蛋白分子剔除于 VLP组成之外,可以显著增强该类疫苗的免疫效力。可以为实现多价和 /或多种病毒抗原的同时免疫,构建多价或多联疫苗,实现一针多防的目的(Chu et al.,2016;Jennings and Bachmann,2008),如利用猪细小病毒 VP2蛋白与疟原虫 CS蛋白上的 CD8+T细胞表位共表达(Rodriguez et al.,2012),利用乙型肝炎核心抗原展示Ⅱ型登革热病毒的囊膜蛋白 E Ⅲ区(ED3)(Arora et al.,2012)等,构建嵌合 VLP。
  (4)可以利用 VLP作为某些小分子或者药物递送的载体(Kim et al.,2019;Pretto and van Hest,2019;Zdanowicz and Chroboczek,2016),如基于载体递送病毒样颗粒 Caspase 8至乳腺癌细胞,可以诱导肿瘤细胞的凋亡并抑制肿瘤生长(Ao et al.,2019);另外,利用 VLP作为 DNA疫苗(Jin et al.,2007)或者 RNA递送的载体(Finbloom et al.,2018),可以提高 DNA疫苗的免疫效力或者用于基因治疗(Zhitnyuk et al.,2018)。
  (5)VLP除了作为疫苗和递送载体外,还可用于研究病毒蛋白装配及分子之间相互作用机制的工具(Chambers et al.,1996;Sabapathy et al.,2019;Tsukamoto et al.,2007)。尤其适用于高致病性病原的相关研究,如埃博拉病毒(Silvestri et al.,2007)、流感病毒(Makarkov et al.,2017)等,研究过程中不依赖于高等级生物安全防护设施,具有较高的便利性。
  (6)在传统疫苗生产过程中某些具有高致病性的病原(如口蹄疫、高致病性禽流感)需要高等级的生物安全防护设施,存在着病原逃逸和泄漏的风险,生产成本较高。但是在相关 VLP疫苗制备过程中,不需要操作病原,不需要高等级的生物安全防护设施,一次性投入成本不高。
  三、病毒样颗粒的不足
  (1)从某种程度上来说, VLP疫苗仍属于亚单位疫苗范畴,其分子量和蛋白质结构复杂程度低于天然病毒,所以其免疫原性通常会低于天然病毒。
  (2)某些 VLP的衣壳蛋白需要翻译后修饰,需要真核表达系统进行 VLP的生产和制备,所以制造成本相对较高。另外,利用真核表达系统进行 VLP的生产和制备,通常需要较为复杂的纯化步骤,又增加了 VLP疫苗的生产制造成本。
  (3)不同表达系统对于相同的 VLP的结构和生产过程都会造成一定的影响。Zhou等(2006)对在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中产生的重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)进行了鉴定,所制备的抗原颗粒的分子量、大小和单体数均表现出显著差异。在 CHO细胞中,HBsAg颗粒的分子量为 4.9 kDa,粒径为 22.1 nm,更接近于天然病毒,同时单体平均数为 155个;酵母来源的抗原颗粒较小(分子量为 3.0 kDa,粒径为 18.1 nm),含有较少的单体(n=86)。因此证明,CHO细胞更适合于生产乙型肝炎病毒表面抗原,并推测其应具备更好的免疫原性。这些现象也要求在生产 VLP疫苗之前,需要对表达系统进行筛选,以此生成具有更好免疫原性的疫苗。
  (4)VLP疫苗生产和制备需要复杂的蛋白质纯化及浓缩工艺。例如,实验证明, CHO中分离的重组 HBsAg颗粒含有糖基化和非糖基化两种形式(Zhou et al.,2006),为了达到疫苗抗原均质化的要求,必须进行下游蛋白质纯化和浓缩。而酵母来源的 HPV VLP由高度异质性的、大小分布不规则的 VLP组成,因此,也需要复杂的蛋白质纯化工艺来满足质量要求。另外,细胞内组装的 VLP可能含有宿主蛋白或 DNA等杂质。污染物的水平不同,可能具有不同的不良生物反应,因此需要进一步处理以满足生物制药产品的严格要求。此外, VLP本身可能与宿主细胞中的蛋白质结合,从而在一定程度上污染了 VLP的外部,也因此增加了下游加工的复杂性。
  (5)尽管可以通过与其他病原体的优势抗原表位共表达,构建嵌合 VLP,但是外源抗原表位或者抗原肽的长度受到一定限制,否则会干扰或者破坏 VLP的空间构象(Pumpens et al.,1995)。另外,由于空间位置的限制,引入的外源抗原肽的正确折叠存在一定的障碍,降低了重组蛋白的活性或免疫效力。
  (6)在生产制备具有复杂结构的 VLP时,制备产物的异质性较高,需要复杂的下游纯化工艺才能获得同质性较好的产品。例如,在昆虫细胞内共表达轮状病毒结构蛋白 VP2、VP6和 VP7(很少同时共表达 VP2、VP6、VP4和 VP7四种结构蛋白)构建具有三层结构的 VLP时(Istrate et al.,2008),通常同时存在有单层、双层和三层衣壳的 VLP(Vieira et al.,2005),通常需要较为复杂的纯化步骤去除细胞杂质、单层和双层 VLP,这极大地降低了目标产物的产量,并且增加了制备难度和成本(Mena et al.,2005;Peixoto et al.,2007;Roldao et al.,2012)。
  第二节病毒样颗粒的分类
  基于母本病毒的结构特征, VLP通常可以分为两大类:无囊膜 VLP和有囊膜 VLP。无囊膜 VLP通常由一个或多个衣壳蛋白自我组装而成,它们不包含任何宿主细胞成分。某些无囊膜病毒的一个衣壳蛋白单独表达即可自我装配成 VLP结构,如人乳头状瘤病毒的 L1蛋白(Harro et al.,2001;Hagensee et al.,1993)、猪细小病毒的 VP2蛋白(Gilbert et al.,2006)、猪圆环病毒的 ORF2蛋白(Wu et al.,2016)的单独表达即可以装配成与天然病毒较为相似的 VLP;而口蹄疫病毒、鸡传染性法氏囊病毒等则需要多个结构蛋白的参与才能装配成 VLP结构。另外,尽管蓝舌病病毒、轮状病毒的 VP2蛋白就可以形成 VLP结构,但是中间层和昀外层衣壳蛋白的参与是形成生物学活性更好的 VLP所必需的。
  相比于无囊膜 VLP,有囊膜 VLP的结构较为复杂,其包含来源于宿主细胞的细胞膜成分。囊膜成分覆盖于 VLP表面,表现出与天然病毒相似的结构和功能,包括人免疫缺陷病毒(Buonaguro et al.,2013;Delchambre et al.,1989;Gheysen et al.,1989)、流感病毒(Yamshchikov et al.,1995)、乙型肝炎病毒(McAleer et al.,1984)、丙型肝炎病毒(Baumert et al.,1998)、副黏病毒(Park et al.,2014)VLP等。
  此外,在无囊膜 VLP和有囊膜 VLP的基础上,构建表达异源抗原表位的重组嵌合 VLP,常用于获得无法形成 VLP的特殊病毒衣壳蛋白或药物载体等(Chu et al.,2016; Li et al.,2016;Shen et al.,2013)。例如,利用对称模型结合计算机蛋白质 -蛋白质界面设计的方法,获得具有四面体和八面体对称结构的精确蛋白质组件,这种组件可携带病毒特异的衣壳蛋白或具有免疫优势的抗原蛋白。有报道称,研究人员通过计算机设计从自组装的三聚体构架获得二十面体纳米笼,并可嵌合如绿色荧光蛋白(GFP)等高分子量蛋白质且保持结构稳定,不仅提高了内部体积,而且扩展了嵌合型 VLP作为异源蛋白质递送系统的生物应用范围。
  第三节病毒样颗粒的发展历程
  一、病毒样颗粒技术的进展
  获得 VLP的方法,可以根据非嵌合型和嵌合型来简单分类,对于非嵌合型的 VLP,主要直接将病原衣壳蛋白构建于表达载体,并在相应的真核或原核表达系统中组装获得,或者是在表达系统中表达出衣壳蛋白后,纯化蛋白并在缓冲液的环境中组装出 VLP,如目前应用的猪圆环病毒 VLP疫苗,以及国内已获得国家一类新兽药证书的口蹄疫病毒 VLP疫苗。但大多数病毒的衣壳蛋白或抗原蛋白必须通过不同的方式获得嵌合型 VLP,以保证获得比亚单位呈现更多构象表位的 VLP疫苗,嵌合的方式包括基因融合及利用 VLP上赖氨酸和抗原上半胱氨酸化学偶联的传统方式,也包括几种较新型的嵌合方式,如利用非共价作用的粘贴(stick)法;共价作用的非天然氨基酸生物正交点击(click)化学法和 spy tag/spy catcher自发异肽键分子黏合(glue)法。传统嵌合方法具有挑战性,特别是对于复杂的、带有多种翻译后修饰的全长抗原分子。就基因融合而言,外壳蛋白氨基酸的末端是昀需要弯曲的部分,因此与 VLP的稳定性密切相关,融合其他外壳蛋白氨基酸的末端可能会使 VLP不稳定。融合的外壳蛋白氨基酸末端伸入 VLP的内部则不利于诱导抗体产生。环形的衣壳蛋白亚基可以耐受插入一些短肽,但是在环形衣壳蛋白亚基中插入一个完整抗原蛋白通常会影响衣壳蛋白亚基和 /或蛋白质抗原的折叠。VLP的组装过程通常是亚稳态,基因融合方法可能会对 VLP的组装产生严重干扰。此外,抗原结构复杂、翻译修饰多样、构象多变、抗原序列容易变异等因素均导致基因融合方法很难有效推进。
  新型嵌合方式获得 VLP的方法统称模块化 VLP组装,是指经过多个步骤生成基于 VLP的疫苗,特别是, VLP和抗原分别生成,然后偶联。与基因融合相比,模块化 VLP的组装增加了一个额外的步骤,因此在理论上

TOP 其它信息

装  帧:平装

版  次:1

开  本:16开

纸  张:胶版纸

加载页面用时:78.136